Утверждаю
Главный
государственный
санитарный врач
Российской
Федерации,
Первый заместитель
Министра
здравоохранения
Российской
Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
20 сентября 2001
года
Дата введения:
с момента
утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ
КЛЕТОК
МИКРООРГАНИЗМА TRICHODERMA LONGIBRACHIATUM TW-1 -
ПРОДУЦЕНТА
БЕТА-ГЛЮКАНАЗЫ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.1070-01
1. Разработаны
к.м.н. В.И. Бобровым (ВНЦ по безопасности биологически
активных веществ).
2. Утверждены и
введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской
Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 20
сентября 2001 г.
3. Введены впервые.
1. Общие
положения и область применения
Настоящие
методические указания устанавливают методику проведения микробиологического
количественного анализа концентрации клеток штамма - Trichoderma
longibrachiatum TW-1 - продуцента бета-глюканазы в воздухе рабочей зоны в
диапазоне концентраций от 100 до 6000 клеток в 1 куб. м воздуха.
Методические
указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ.
Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".
Методические
указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и
учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения
микробиологических исследований.
2.
Характеристика штамма-продуцента бета-глюканазы
Продуцент
бета-глюканазы Trichoderma longibrachiatum TW-1 относится к классу
несовершенных грибов. Рост характерных колоний определяется на 5 - 6 сутки. На
агаризованной среде СМ микроорганизм образует
характерные колонии до 15 мм в диаметре с гладкой подошвой, не врастающие в
агар, с волнистым краем, пушистым воздушным мицелием, который покрыт спорами
белого и желтого цвета. Гифы мицелия бесцветные, септированные, многократно
ветвистые. Оптимальная температура роста 28 - 30 °С.
Предельно
допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 5000 кл./куб. м, 3 класс
опасности, пометка А.
3. Пределы
измерений
Методика
обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента бета-глюканазы в
воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 6000 клеток в 1 куб. м
воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод
измерений
Метод измерения
концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток
(спор, фрагментов мицелия) продуцента бета-глюканазы на поверхность плотной
питательной среды СМ и подсчете выросших колоний по
зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма как результат
продукции бета-глюканазы на среде с окрашенной целлюлозой.
5. Средства
измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и
материалы
При выполнении
измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и
материалы.
5.1.
Средства измерений, вспомогательные устройства,
материалы
Прибор
для бактериологического анализа
воздуха,
модель 818 (щелевой прибор Кротова)
ТУ 64-12791 77
Термостаты
электрические суховоздушные или
водяные
Автоклав
электрический
ГОСТ 9586-75
Бокс,
оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник
бытовой
Весы
лабораторные аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп
биологический с иммерсионной
системой
типа "Биолам" Л-211
Лупа
с увеличением х 10
ГОСТ 25706-83
Чашки
Петри бактериологические плоскодонные
стеклянные
диаметром 100 мм
Пробирки
биологические вместимостью 20 и 35 мл
ГОСТ 10515-75
Пипетки
мерные на 1, 5 и 10 мл
ГОСТ 10515-75
Пипетки
мерные на 1, 5 и 10 мл
ГОСТ 1770-74
Колбы
конические вместимостью 250 и 500 мл
ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ
9586-75
Барометр
ГОСТ 24696-79
Марля
медицинская
ГОСТ 9412-77
Вата
медицинская гигроскопическая
ГОСТ 25556-81.
5.2.
Реактивы, растворы
Бенгальский
розовый
Диметилсульфоксид
Спирт
этиловый ректификат
ГОСТ 5962-67
Селективная
среда для штамма-продуцента
бета-глюканазы
Состав
среды: KH PO - 1 г; MgSO х 7Н О -
2 4
4 2
0,5
г; (NH ) SO - 5
г; целлюлоза порошковая в
4 2
4
пересчете на сухое вещество - 5 г; глюкоза -
5
г; дрожжевой экстракт - 0,5 г; агар - 20 г;
вода
дистиллированная - до 1000 мл.
6.
Требования безопасности
При выполнении
измерений концентрации клеток продуцента бета-глюканазы в воздухе рабочей зоны
соблюдают:
- правила техники
безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;
- правила
электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и
инструкцию по эксплуатации прибора;
- требования,
изложенные в руководстве "Положение об организации работы по технике
безопасности в микробиологической промышленности" (1980);
- положения
"Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при
работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической
промышленности" (1977).
Все виды работ с
реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с
биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными
лампами.
7.
Требования к квалификации операторов
К выполнению
измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним
специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки
работы в области микробиологических исследований.
8. Условия
измерений
Процессы
приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных
условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности
воздуха не более 80%.
9.
Проведение измерений
9.1.
Условия отбора проб воздуха
Для определения
продуцента бета-глюканазы воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со
скоростью 10 л/мин. на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации
воздуха (1 - 10 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента,
а прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.
Аппарат Кротова
перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно
тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку
прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки.
На подвижный диск
устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее
крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо.
После отбора пробы
воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и
закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают
точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2.
Выполнение анализа
Метод предполагает
учет количества колоний, выросших на 2 - 3 сутки после посева проб воздуха, по
зонам просветления, которые являются результатом образования целлюлаз на срезах
с окрашенной целлюлозой в присутствии повышенного количества глюкозы.
Существенным
признаком промышленных мутантов рода Trichoderma является пониженная
катаболическая репрессия по сравнению с дикими мутантами Trichoderma. В то
время как у диких штаммов глюкоза в концентрациях выше 0,02 г/л практически
полностью подавляет образование целлюлаз в глубинной культуре, у промышленных
мутантов подавление образования целлюлаз начинается при концентрациях глюкозы
выше 1 г/л.
Селективную среду
расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/л
бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметил-сульфоксида, тщательно
перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной
поверхности. Бенгальский розовый предназначен для
специфического окрашивания целлюлозы и для ограничения разрастания колоний на
чашках. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре
37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные
чашки используют для контроля воздуха.
После отбора проб
воздуха чашки Петри помещают в термостат при 28 - 30 °С
на 2 дня и затем при температуре 44 °С на 18 ч для образования вокруг колоний
зон просветления.
Количественный учет
микробных клеток штамма-продуцента бета-глюканазы проводится методом подсчета
зон просветления, образующихся вокруг колоний микроорганизма как результат
продукции глюканазы на среде СМ с окрашенной
целлюлозой.
10.
Вычисление результатов измерений
Расчет концентрации
клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:
N х 1000
Х = --------, кл./куб. м,
V
где:
Х - концентрация
клеток продуцента в воздухе;
N - количество
колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент
пересчета на 1 куб. м воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
11.
Оформление результатов измерений
Результаты
измерений оформляют протоколом по форме:
Протокол N ___
количественного
микробиологического анализа
штамма-продуцента
Trichoderma longibrachiatum TW-1
в воздухе рабочей
зоны
Дата
проведения анализа ______________________________________
Место
отбора пробы ___________________________________________
Название
лаборатории _________________________________________
Юридический адрес организации ________________________________
Результаты
микробиологического анализа
|
Шифр или N пробы
|
Определяемый
микроорганизм
|
Концентрация,
кл./куб. м
|
|
|
|
|
Ответственный
исполнитель
Научный
руководитель
Список
литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88
"ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические
требования".
2. ГОСТ Р 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".
3. Положение об
организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности
(М., 1980, 27 с.).
4. Инструкции по
устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в
микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности
(М., 1977, 7 с.).