Утверждаю

Руководитель Федеральной

службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей

и благополучия человека,

Главный государственный

санитарный врач

Российской Федерации

Г.Г.ОНИЩЕНКО

4 августа 2010 года

 

Дата введения:

4 октября 2010 года

 

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ

И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

 

МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК

B. AMYLOLIQUEFACIENS ВКПМ В-10291 - ПРОДУЦЕНТА

АЛЬФА-АМИЛАЗЫ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУК 4.2.2718-10

 

1. Разработаны ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 4 августа 2010 г.

4. Введены в действие с 4 октября 2010 г.

5. Введены впервые.

 

1. Общие положения и область применения

 

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма B. amyloliquefaciens ВКПМ В-10291 - продуцента альфа-амилазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 5 до 500000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".

Методические указания предназначены для применения учреждениями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также лабораториями других организаций, аккредитованными в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды".

 

2. Биологическая характеристика B. amyloliquefaciens

ВКПМ В-10291 и его гигиенический норматив

 

Штамм B. amyloliquefaciens ВКПМ В-10291 является продуцентом альфа-амилазы. Получен из штамма B. amyloliquefaciens ВКПМ В-5144 с помощью генетических методов, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов.

Растет на агаризованных средах (МПА, LB-агар и др.) при 36 - 37 °C в течение 24 - 36 ч. На LB-агаре колонии достигают максимального диаметра 6 - 7 см. Колонии округлые, розовато-кремового цвета, края ровные, поверхность колонии матовая, шероховатая, консистенция зернистая. На агаризованной среде с крахмалом штамм дает обильный рост и образование зон гидролиза вокруг колоний, желатин разжижает, восстанавливает лакмусовое молоко. Устойчив к отдельным бета-лактамным антибиотикам, тетрациклину, полимиксину, рифампицину, сульфометаксозолу.

Клетки представляют собой грамположительные одиночные подвижные палочки размером 0,6 - 0,8 x 0,2 - 0,3 мкм, образующие споры, имеющие центральное положение и овальную форму.

 

Систематическое положение микроорганизма

 

    Класс                                                 Schizomycetes

    Отряд                                                 Eubacteriales

    Семейство                                             Bacillaceae

    Род                                                   Bacillus

    Вид                                                   amyloliquefaciens

    Штамм                                                 ВКПМ В-10291

 

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 50000 кл./куб. м, пометка А.

 

3. Пределы измерений

 

Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток микроорганизма в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 5 до 500000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.

 

4. Метод измерений

 

Прямой метод основан на аспирации из воздуха производственных помещений клеток микроорганизма на среду МПА и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

Дополнительный физиолого-биохимический метод основан на аспирации из воздуха клеток микроорганизма на поверхность плотной питательной среды, содержащей крахмал, и подсчете зон гидролиза (просветления) вокруг колоний через 24 - 48 ч. При данном методе на одной чашке Петри после забора пробы может быть учтено не более 50 колоний на чашке, т.к. большее количество колоний на чашке образуют сливающиеся зоны гидролиза, что затрудняет подсчет колоний.

 

5. Средства измерений, вспомогательные устройства,

реактивы и материалы

 

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

 

5.1. Средства измерений, вспомогательные

устройства, материалы

 

Импактор микробиологический "Флора-100"           ТУ 9443-001-05031637-2002

Прибор для бактериологического анализа

воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова)      ТУ 64-12791-77

Прибор MAS-100 ECO фирмы "Merk" (Германия)

для отбора проб воздуха, возможно также

использование других аналогов пробоотборника

Термостаты электрические                          ГОСТ 10444.15-94

Автоклав электрический                            ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой                               ГОСТ 26678-85

Ареометр-сахарометр с диапазоном измерений

0 - 10% с ценой деления 0,1%                      ГОСТ 18481-87

Весы лабораторные ВЛКТ-500                        ГОСТ 24104-88

Микроскоп биологический с иммерсионной

системой типа "Биолам Л-211"

Лупа с увеличением x10                            ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные,

стеклянные, диаметром 90 мм                       ГОСТ 23932-90

Пробирки бактериологические П1 и П2

вместимостью 15 и 20 мл                           ГОСТ 25336-82

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                    ГОСТ 1770-74

Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл        ГОСТ 1770-74

Секундомер                                        ГОСТ 9586-75

Барометр                                          ГОСТ 24696-79

Марля медицинская                                 ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая                 ГОСТ 25556-81

 

5.2. Реактивы, растворы

 

Агар микробиологический                           ГОСТ 17206-84

Экстракт солодовый                                ГОСТ 418-84

Вода дистиллированная                             ГОСТ 6709-72

Антибиотики: линкомицин, рифампицин

Спирт этиловый ректификат                         ГОСТ 5962-67

Растворимый крахмал                               ГОСТ 10163-76

Агаризованная среда МПА (агар - 1,5 - 1,8%,

pH 7,5 - 7,8, режим стерилизации 1,1 - 1,2 ати

в течение 30 мин.).

Среда МПБСА (мясо-пептонный бульон и солодовое сусло 7° Б в соотношении 1:1, растворимый крахмал - 1%, агар - 2,5%). Для приготовления солодового сусла 7° Б солодовый экстракт растворяют в дистиллированной воде до 7% содержания сахара с помощью ареометра.

 

6. Требования безопасности

 

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. Санитарные правила СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами".

6.2. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.3. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.4. Руководство "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980), "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

 

7. Требования к квалификации операторов

 

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

 

8. Условия измерений

 

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, атмосферном давлении 740 - 760 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 70%.

 

9. Проведение измерения

 

9.1. Условия отбора проб воздуха

 

Для определения концентрации клеток микроорганизма воздух аспирируют при помощи пробоотборника со скоростью 100 л/мин. на поверхность плотной питательной агаризованной среды. Время аспирации воздуха (1 - 5 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

 

9.2. Выполнение анализа

 

При выполнении анализа воздуха прямым методом МПА расплавляют, остужают до 50 - 60 °C, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика линкомицина (или рифампицина) из расчета 15 - 20 мкг/мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °C, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой 36 - 37 °C. Через 24 - 48 ч производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам (прямой метод).

При микробиологическом анализе воздуха производственных помещений дополнительными функционально-биохимическими методами пробы воздуха отбирают на чашки Петри с МПБСА. Затем чашки инкубируют в термостате при 36 - 37 °C в течение 24 - 48 ч и подсчитывают количество зон гидролиза (просветления) вокруг выросших колоний.

Ростовые свойства всех используемых питательных сред должны быть проверены в соответствии с "Требованиями к ростовым свойствам питательных сред" (Государственная Фармакопея СССР, изд. XI, вып. 2, с. 208), что позволит более полно оценить пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается на 2 - 3 чашки каждой используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать в 2 - 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

 

10. Вычисление результатов измерения

 

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:

 

                             N x 1000

                         X = --------, кл./куб. м,

                                V

 

где:

X - концентрация клеток продуцента в воздухе;

N - количество зон вокруг колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

 

11. Оформление результатов измерений

 

Результаты измерений оформляют протоколом по форме:

 

Протокол N

количественного микробиологического анализа

штамма-продуцента B. amyloliquefaciens ВКПМ В-10291

в воздухе рабочей зоны

 

1. Наименование и адрес испытательной лаборатории (центра), проводящей измерения, аттестат аккредитации лаборатории.

2. Юридический и фактический адрес организации-заказчика.

3. Идентификация используемого метода, методики, ссылки на методы, используемые испытательной лабораторией.

4. Описание состояния объекта исследования.

5. Дата получения объекта измерений и дата проведения анализа.

6. Место отбора пробы.

 

Результаты микробиологического анализа

 

Шифр или N пробы	Определяемый микроорганизм	Концентрация, кл./куб. м

 

Ответственный исполнитель:

Руководитель:

 

Список литературы

 

1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования".

2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ "Методики выполнения измерений".

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.