Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в
сфере
защиты прав
потребителей
и благополучия
человека,
Главный
государственный
санитарный врач
Российской
Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
6 августа 2007 года
Дата введения:
1 октября 2007 года
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК И
СПОР
BACILLUS SUBTILIS 24Д - ДЕЙСТВУЮЩЕГО ВЕЩЕСТВА
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ФУНГИЦИДА "ИНТЕГРАЛ"
В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.2233-07
1. Рекомендованы к
утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому
нормированию Федеральной службы по надзору в сфере прав потребителей и
благополучия человека (протокол от 29 марта 2007 г. N 1).
2. Утверждены Руководителем
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия
человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.
Онищенко 6 августа 2007 г.
3. Разработаны ОАО "Всероссийский научный центр по безопасности биологически
активных веществ".
4. Введены в
действие с 1 октября 2007 г.
1. Общие
положения и область применения
Настоящие
методические указания устанавливают методику проведения микробиологического
количественного анализа концентрации клеток и спор штамма Bacillus subtilis 24Д
в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций 10 - 50000 клеток в 1 куб. м
воздуха.
Методические
указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля штамма
Bacillus subtilis 24Д в воздухе производственных помещений биотехнологического
цеха и оценки соответствия уровня его содержания гигиеническим нормативам на
основе учета требований ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие
санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ Р
8.563-96 ГСИ "Методики выполнения измерений".
2.
Биологическая характеристика штамма
Bacillus subtilis
24Д
Штамм Bacillus
subtilis 24Д (ВНИИСХМ 129) является действующим веществом микробиологического
фунгицида "Интеграл". Выделен из растений
хлопчатника. Идентифицирован в Институте микробиологии
и вирусологии НАН Украины.
Штамм Bacillus
subtilis 24Д характеризуется следующими культурально-морфологическими и
биохимическими свойствами: грамположительные аэробные спорообразующие палочки,
продуцирующие каталазу. На МПА, сусло-агаре, среде Громыко и картофельном агаре
культура растет обильно. На МПА образует складчатые колонии вязкой
консистенции, телесного цвета, края колонии неправильной формы. На картофельном агаре - колонии светло-телесного цвета,
блестящие, вязкой консистенции края ровные. На сусло-агаре и среде Громыко -
колонии телесного цвета, складчатые, с возвышающимся центром, края -
изрезанные, консистенция - вязкая.
В мазках 18-часовой
культуры обнаруживаются прямые палочковидные клетки размером 1,9 x 0,5 мкм,
расположенные одиночно, реже цепочкой. При спорообразовании клетка не
раздувается. Споры эллипсовидные - 0,9 x 0,5 мкм, в клетке расположены
центрально.
Штамм Bacillus
subtilis 24Д ферментирует глюкозу, лактозу, арабинозу, ксилозу, мальтозу,
маннит, сахарозу с образованием кислоты; не разлагает дульцит, рамнозу; дает
положительную реакцию Фогес-Проскауэра, гидролизует крахмал, желатин, не
гидролизует мочевину; утилизирует цитрат; пропионат не использует. Не растет в
анаэробных условиях, не образует включения поли-бета-оксимасляной кислоты на
МПА с глюкозой; не обладает летициназной активностью; индол и сероводород не
образует. Штамм не патогенен.
Штамм Bacillus subtilis
24Д проявляет антагонистическую активность в отношении фитопатогенных грибов
классов фикомицеты, базидиомицеты класса несовершенных грибов, бактерий родов
Erwinia, Pseudomonas и Xanthomonas.
Штамм Bacillus
subtilis 24Д размножают и хранят на МПА, сусло-агаре, среде Громыко,
картофельном агаре. Рост при температуре 32 - 34 °C в течение 24 ч.
Для обнаружения
штамма применяют посев проб на агаризованные питательные среды с последующим
тестированием культуры по типичным морфологическим признакам.
3. Пределы
измерений
Методика
обеспечивает выполнение измерений количества клеток и спор штамма Bacillus
subtilis 24Д в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 10 до 50000
клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод
измерений
Метод измерения
концентрации основан на аспирации микробных клеток и спор штамма Bacillus
subtilis 24Д из воздуха на поверхность плотной питательной среды и подсчете
выросших колоний по типичным морфологическим признакам.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и
материалы
При выполнении
измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы.
5.1.
Средства измерений, вспомогательные
устройства,
материалы <*>
--------------------------------
<*>
Допускается использование аналогичных средств измерений и вспомогательных
устройств с техническими характеристиками не ниже, чем у указанных в п. 5.1
данной методики и разрешенных к применению в соответствии с утвержденными в
установленном порядке методическими указаниями по методам контроля.
Прибор
для бактериологического анализа воздуха,
модель
818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77
Термостат
электрический суховоздушный
ГОСТ 9586-75
Автоклав
электрический
Бокс,
оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник
бытовой
Весы
лабораторные аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп
биологический с иммерсионной
системой
типа "Биолам" Л-211
Водяная
баня или водяной термостат
Ареометр-сахарометр
АСТ 5-15
pH-метр
Газовая
горелка или спиртовка лабораторная
Чашки
Петри плоскодонные стеклянные, диаметром 10 мм ГОСТ 25336-92
Петли
бактериологические
Пробирки
биологические вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 29227-91
Пипетки
мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 29227-91
Колбы
конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Секундомер
ГОСТ 9586-75
Барометр ГОСТ 24696-79
Марля
медицинская
ГОСТ 9412-77
Вата
медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81
5.2. Реактивы, питательные среды и их компоненты <*>
--------------------------------
<*>
Допускается использование питательных сред и их компонентов, изготовленных по
другой нормативной документации, при условии аналогичного состава и
качественных показателей не ниже, чем у указанных в п. 5.2 данной методики.
Агар
микробиологический ГОСТ 17206-96
Концентрат
сусла пивного неохмеленного
ТУ 10-04.06.114-88
Вода дистиллированная ГОСТ
6709-72
Натрия
гидроокись, ч. ГОСТ 4328-77
Амфотерицин
B
ФС 42-2051-99
Мясо-пептонный бульон ГОСТ
20730-75
6.
Требования безопасности
При выполнении
измерений концентрации клеток и спор штамма Bacillus subtilis 24Д в воздухе
рабочей зоны соблюдают правила техники безопасности при работе с химическими
реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.005-88;
- правила
электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ
12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов;
- требования,
изложенные в руководстве "Положение об организации работы по технике
безопасности в микробиологической промышленности" (1980);
- положения
"Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при
работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической
промышленности" (1977).
Все виды работ с
реактивами проводят только в вытяжном шкафу, при работающей вентиляции, работа
с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными
лампами.
7.
Требования к квалификации оператора
К выполнению
измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним
специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки
работы в области микробиологических исследований.
8.
Проведение измерения
8.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения
концентрации микроорганизма производят отбор проб воздуха при помощи аппарата
Кротова (п. 5, примечание 1) со скоростью 10 л/мин. на поверхность плотной
питательной среды. Время отбора одной пробы воздуха 20 мин. Аппарат Кротова
перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно
обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную
и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную
чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают.
Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы
воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и
закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают
точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы. В период отбора пробы
воздуха крышку чашки Петри хранят в стерильном пакете из бумаги, полиэтилена
или другой стерильной емкости.
Отбор проб
сопровождается составлением акта отбора пробы с указанием места, времени и
условий отбора.
8.2.
Выполнение анализа
Метод предполагает
учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 3 -
4-е сут. после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200
колоний.
Подготавливают
питательную среду: сусло-агар или среду Громыко. Сусло-агар готовят по
общепринятой методике из концентрата сусла пивного неохмеленного (п. 5.2) путем
разбавления его дистиллированной водой до общей концентрации сахаров 10% (10°
Баллинга), pH 7,0 - 7,2 (при необходимости pH доводят до необходимого значения
путем добавления 10%-го раствора гидроокиси натрия) с добавлением 2,0 - 2,5%
агар-агара. Среду Громыко готовят по общепринятой методике из мясо-пептонного бульона и сусла пивного неохмеленного с
концентрацией сахаров 7% (7° Баллинга), взятых в соотношении 1:1, с добавлением
2,0 - 2,5% агар-агара, pH-среды 7,0 - 7,2. Общую концентрацию сахаров в сусле
определяют по ареометру.
Подготовленную
среду расплавляют на водяной бане, остужают до 50 - 60 °C и добавляют в нее
раствор амфотерицина B в стерильной дистиллированной воде из расчета 10 мкг
амфотерицина В на 1 мл питательной среды для
подавления посторонней воздушной микофлоры.
У каждой партии
подготовленной питательной среды проверяют ростовые свойства. Используемые
питательные среды должны обеспечивать рост микроорганизмов Bacillus subtilis
24Д при посеве их в количестве менее 100 жизнеспособных клеток не позднее 24 ч
при температуре 32 - 34 °C.
Готовую питательную
среду тщательно перемешивают и разливают по 20 мл в стерильные чашки Петри,
установленные на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают
в термостат на сутки при температуре 30 - 35 °C, после чего проросшие чашки
бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.
Культивирование
проб воздуха, отобранных согласно п. 8.1, ведут в течение 24 ч при температуре
32 - 34 °C с последующим учетом выросших типичных колоний штамма Bacillus
subtilis 24Д. При необходимости выросшую культуру подвергают микроскопической
идентификации (окраска мазков - по Граму).
9.
Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации
клеток в перерасчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:
К = (П x 1000) x С x Т,
где:
К - концентрация штамма Bacillus subtilis 24Д в воздухе, кл./куб. м;
П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1000 - коэффициент
перерасчета на 1 куб. м воздуха;
С - скорость аспирации воздуха, л/мин.;
Т - время
аспирации, мин.
10.
Оформление результатов измерений
Результаты
измерений оформляют протоколом по приведенной форме.
Протокол N __
оценки содержания
микроорганизма Bacillus subtilis 24Д
в воздухе рабочей
зоны
1. Дата
проведения анализа ____________________________________________
2. Рабочее
место (профессия работающего)
______________________________
3. Место отбора пробы (название
и адрес организации,
производство,
технологическая стадия, точка отбора пробы)
_______________________________
___________________________________________________________________________
4. Вид
пробоотборника _________________________________________________
5. Дата
последней метрологической поверки оборудования для отбора проб
___________________________________________________________________________
6.
Питательная среда, время инкубации _________________________________
7.
Количественная и качественная характеристика выросших
колоний
(количество типичных колоний, морфологические
признаки, окраска по Граму)
___________________________________________________________________________
8.
Результаты идентификации микроорганизмов с указанием метода ________
___________________________________________________________________________
9.
Результаты расчета концентрации Bacillus subtilis 24Д ______________
___________________________________________________________________________
10.
Соотношение полученных результатов с уровнем ПДК _______________
Р.З.
___________________________________________________________________________
11. Отбор
пробы проведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись) ___________
___________________________________________________________________________
12.
Идентификация штамма и расчет концентрации проведены
(Ф.И.О., должность, дата, подпись) ________________________________________
Список
литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88
"ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические
требования".
2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ. "Методики выполнения измерений".
3. Положение об
организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности.
М., 1980. 27 с.
4. Инструкция по
устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в
микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности.
М., 1977. 7 с.
5. Государственная
фармакопея СССР, изд. XI, вып. 2. Общие методы анализа. М.: Медицина, 1990.
6. Р 2.2.2006-05 "Руководство по гигиенической оценке
факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий
труда".